PCR digital: nueva tecnología para la detección temprana de la recaída en pacientes de cáncer hematológico
La PCR digital (dPCR) es un nuevo enfoque para la cuantificación absoluta (no necesita ningún gen de referencia) y la detección de alelos raros. Esta funciona mediante la partición de la muestra de ADN en muchas PCR individuales en paralelo.
En los trasplantes de médula ósea alogénicos (células provenientes de un individuo diferente) la persona que recibe el trasplante se convierte en una quimera, esto es porque ahora posee algunas células genéticamente diferentes a las suyas. El seguimiento de estas quimeras postrasplante se realizaba mediante técnicas y marcadores moleculares, como la técnica FISH y el análisis molecular de polimorfismos VNTR o STR. Pero múltiples estudios han demostrado que estas estrategias no tienen la suficiente sensibilidad y precisión como para ser consideradas óptimas en la predicción de una recaída temprana.
En los últimos años se ha demostrado que la PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR) tiene una mayor sensibilidad, pudiendo detectar hasta un 0.01% de ADN del receptor en muestras de sangre. Con este sistema de detección la sensibilidad mejoró y la recaída de enfermedades como la leucemia aguda, se anticipó en el 88% de los casos. Aunque es evidente que este método es más sensible, también es cierto que esta técnica conlleva un error técnico inherente al método, que puede provocar una variación del valor verdadero.
La dPCR ofrece una cuantificación absoluta con precisión, con una sensibilidad y exactitud superiores a los métodos moleculares tradicionales.
Esta técnica consiste en dividir la muestra en miles de réplicas funcionales, eliminando así la necesidad de utilizar réplicas técnicas y curvas de calibrado, además ha demostrado una mayor precisión y robustez en presencia de inhibidores de la PCR, permite el diseño de ensayos multiplexados sin comprometer la sensibilidad del sistema de cuantificación.
En un estudio recientemente publicado por el Instituto de Medica Genómica de Valencia y el Hospital Regional Universitario de Málaga se seleccionaron marcadores informativos para cada paciente mediante ensayos de genotipado de muestras pretrasplante del receptor y del donante, usando sistemas de PCR específicos para la detección de genes presentes en el cromosoma Y, alelos nulos o polimorfismos de inserción/delección. Una vez seleccionados los marcadores informativos se analizaron las muestras postrasplantes de ADN genómico de la sangre periférica de 28 pacientes que se habían sometido a un trasplante alogénico de médula ósea.
Los resultados dieron una detección previa a la recaída en todos los pacientes.
El 56% de las recaídas fueron predichas mediante dPCR y el 38% mediante el uso de dPCR en conjunto con qPCR, y sólo en un caso la recaída se predijo con el uso de qPCR.
Al observar los tiempos de análisis postrasplante se ha visto que la dPCR puede predecir las recaídas con una anticipación de 63 días, frente a los 45 días que necesita la qPCR. Aun que parece poca diferencia, esto son 17 días de antelación para comenzar a aplicar terapias que eviten la recaída del paciente.
Con estos datos podemos considerar que la dPCR a partir de ADN extraído de sangre periférica, constituye un nuevo enfoque para la detección del quimerismo y nos aporta un pronóstico más rápido de la recaída en comparación con la qPCR, lo cual puede afectar favorablemente a la salud y supervivencia de los pacientes sometidos a trasplantes alogénicos de células hematopoyéticas.
Link
https://revistageneticamedica.com/2019/03/12/pcr-digital-trasplante/
https://www.thermofisher.com/es/es/home/life-science/pcr/digital-pcr.html
Referencia
Valero-Garcia J et al. Earlier relapse detection after allogeneic haematopoietic stem cell transplantation by chimerism assays: Digital PCR versus quantitative real-time PCR of insertion/deletion polymorphisms. PLoS ONE. 2019; 14(2): e0212708. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0212708
By Alejandro Polo (GMed)
La PCR digital (dPCR) es un nuevo enfoque para la cuantificación absoluta (no necesita ningún gen de referencia) y la detección de alelos raros. Esta funciona mediante la partición de la muestra de ADN en muchas PCR individuales en paralelo.
En los trasplantes de médula ósea alogénicos (células provenientes de un individuo diferente) la persona que recibe el trasplante se convierte en una quimera, esto es porque ahora posee algunas células genéticamente diferentes a las suyas. El seguimiento de estas quimeras postrasplante se realizaba mediante técnicas y marcadores moleculares, como la técnica FISH y el análisis molecular de polimorfismos VNTR o STR. Pero múltiples estudios han demostrado que estas estrategias no tienen la suficiente sensibilidad y precisión como para ser consideradas óptimas en la predicción de una recaída temprana.En los últimos años se ha demostrado que la PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR) tiene una mayor sensibilidad, pudiendo detectar hasta un 0.01% de ADN del receptor en muestras de sangre. Con este sistema de detección la sensibilidad mejoró y la recaída de enfermedades como la leucemia aguda, se anticipó en el 88% de los casos. Aunque es evidente que este método es más sensible, también es cierto que esta técnica conlleva un error técnico inherente al método, que puede provocar una variación del valor verdadero.
La dPCR ofrece una cuantificación absoluta con precisión, con una sensibilidad y exactitud superiores a los métodos moleculares tradicionales.
Esta técnica consiste en dividir la muestra en miles de réplicas funcionales, eliminando así la necesidad de utilizar réplicas técnicas y curvas de calibrado, además ha demostrado una mayor precisión y robustez en presencia de inhibidores de la PCR, permite el diseño de ensayos multiplexados sin comprometer la sensibilidad del sistema de cuantificación.
En un estudio recientemente publicado por el Instituto de Medica Genómica de Valencia y el Hospital Regional Universitario de Málaga se seleccionaron marcadores informativos para cada paciente mediante ensayos de genotipado de muestras pretrasplante del receptor y del donante, usando sistemas de PCR específicos para la detección de genes presentes en el cromosoma Y, alelos nulos o polimorfismos de inserción/delección. Una vez seleccionados los marcadores informativos se analizaron las muestras postrasplantes de ADN genómico de la sangre periférica de 28 pacientes que se habían sometido a un trasplante alogénico de médula ósea.
Los resultados dieron una detección previa a la recaída en todos los pacientes.
El 56% de las recaídas fueron predichas mediante dPCR y el 38% mediante el uso de dPCR en conjunto con qPCR, y sólo en un caso la recaída se predijo con el uso de qPCR.Al observar los tiempos de análisis postrasplante se ha visto que la dPCR puede predecir las recaídas con una anticipación de 63 días, frente a los 45 días que necesita la qPCR. Aun que parece poca diferencia, esto son 17 días de antelación para comenzar a aplicar terapias que eviten la recaída del paciente.
Con estos datos podemos considerar que la dPCR a partir de ADN extraído de sangre periférica, constituye un nuevo enfoque para la detección del quimerismo y nos aporta un pronóstico más rápido de la recaída en comparación con la qPCR, lo cual puede afectar favorablemente a la salud y supervivencia de los pacientes sometidos a trasplantes alogénicos de células hematopoyéticas.
Link
https://revistageneticamedica.com/2019/03/12/pcr-digital-trasplante/
https://www.thermofisher.com/es/es/home/life-science/pcr/digital-pcr.html
Referencia
Valero-Garcia J et al. Earlier relapse detection after allogeneic haematopoietic stem cell transplantation by chimerism assays: Digital PCR versus quantitative real-time PCR of insertion/deletion polymorphisms. PLoS ONE. 2019; 14(2): e0212708. https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0212708
By Alejandro Polo (GMed)
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